產(chǎn)品信息

正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

CA是生物體內(nèi)常見的有機酸，是重要的食品風(fēng)味物質(zhì)。此外，CA是三羧酸循環(huán)第一步反應(yīng)的產(chǎn)物。

測定原理

酸性條件下，檸檬酸還原Cr⁶⁺生成Cr³⁺，在545nm處有特征吸收峰；通過測定545nm吸光值的增加，即可計算出樣品中檸檬酸含量。

自備儀器和用品

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1支，4℃保存。

試劑四：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前配制，加入5mL試劑一，充分溶解。

試劑五：液體×1瓶，4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1支，250μmol/L檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

樣品處理

1.液體樣品：取1mL液體加試劑一0.9mL，充分混勻，11000g，4℃離心10min，取上清液待測。

2.組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。11000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

3.線粒體：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，600g/min，4℃離心5min；取上清至另一EP管中，11000g，4℃離心10min，棄上清（此上清液可用于細(xì)胞質(zhì)CA含量測定）；向沉淀中加試劑二200μl，以及試劑三2μl，充分懸浮溶解，11000g，4℃離心10min，取上清液待測。

4.細(xì)菌、真菌中：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；11000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

測定操作

1.分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到545 nm，蒸餾水調(diào)零。

2.試劑一置于30℃水浴中預(yù)熱30min。

3.空白管：取EP管，依次加入100μL蒸餾水，700μL試劑一，100μL試劑四，100μL試劑五，混勻后室溫靜置30min，于545nm測定吸光度，記為A空白管。

4.標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管，依次加入100μL標(biāo)準(zhǔn)液，700μL試劑一，100μL試劑四，100μL試劑五，混勻后室溫靜置30min，于545nm測定吸光度，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

5.測定管：取EP管，依次加入100μL上清液，700μL試劑一，100μL試劑四，100μL試劑五，充分混勻后室溫靜置30min，于545nm測定吸光度，記為A測定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。

檸檬酸（citric acid, CA）含量測定試劑盒計算公式 

1.按液體樣品的體積計算

檸檬酸含量（nmol/L）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總= 2500×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L=0.25 m mol/L；樣品稀釋倍數(shù)：（0.1 mL樣品+0.9mL試劑一）÷ 0.1 mL樣品=10；V總：1mL。

2.按組織質(zhì)量計算

檸檬酸含量（nmol/g 鮮重）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷W= 250×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L；V總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；W：樣品質(zhì)量，g。

3.按蛋白含量計算

檸檬酸含量（nmol/mg prot）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷Cpr= 250×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)含量，mg/mL。

4.按細(xì)胞數(shù)量計算

檸檬酸含量（nmol/10⁴ cell）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷細(xì)胞數(shù)量= 250×(A測定管－A空白管) ÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L；V總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；

注意事項

1.樣品處理等過程均需要在冰上進行。

2.試劑四需現(xiàn)配現(xiàn)用，配置好的一周內(nèi)使用完；

3.試劑五為易致癌物質(zhì)，實驗過程中，需佩戴手套，避免試劑五濺到皮膚上。

4.檸檬酸提取液不能用于蛋白含量測定，如需測定蛋白含量，需另取組織，使用本公司BCA試劑盒進行測定。

5.本產(chǎn)品僅作科研用途！

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