RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中，如何判斷RNA是否降解?RNA降解的檢測方法

　　瓊脂糖凝膠電泳?

　　完整RNA?：電泳后應(yīng)顯示清晰的28S和18S rRNA條帶，28S亮度約為18S的2倍(28S:18S≈2:1)。

　　降解RNA?：條帶模糊、拖尾或比例異常(如28S亮度顯著降低)，甚至出現(xiàn)低分子量彌散?。

　　DNA污染?：若加樣孔附近出現(xiàn)熒光區(qū)帶，提示可能存在DNA污染?。

　　紫外分光光度法?

　　純度評估?：OD260/OD280比值1.8-2.1為合格，低于1.8提示蛋白污染，高于2.1可能為RNA降解?。

　　濃度計(jì)算?：OD260值用于定量RNA濃度(1 OD≈40 μg/mL)?。

　　生物分析儀(RIN值)?

　　RIN值?：通過微流體芯片評估RNA完整性，RIN≥7為高質(zhì)量，RIN<5提示嚴(yán)重降解?。

　　RNA降解的常見原因及預(yù)防

　　RNase污染?：使用RNase-free耗材，操作時(shí)佩戴手套并噴RNase Zap?。

　　樣本處理不當(dāng)?：組織未及時(shí)裂解或反復(fù)凍融，需快速低溫保存(-80℃)?。

　　機(jī)械剪切力?：避免劇烈渦旋或槍頭吹打?。

　　實(shí)驗(yàn)優(yōu)化建議

　　預(yù)變性處理?：65℃孵育5分鐘可打開RNA二級結(jié)構(gòu)，提高逆轉(zhuǎn)錄效率?。

　　引物選擇?：Oligo dT引物適用于真核mRNA，隨機(jī)引物適用于降解樣本?。

　　酶選擇?：高GC含量RNA建議使用耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶?。

　　若需進(jìn)一步驗(yàn)證，可通過qPCR擴(kuò)增內(nèi)參基因確認(rèn)cDNA質(zhì)量?。

　　注：以上僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。

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