DNA Polymerase 超高保真DNA聚合酶

　　DNA Polymerase 是一款超高保真 DNA 聚合酶，其采用蛋白融合技術(shù)且具有通用引物退火功能。它是一款融合到持續(xù)合成能力增強(qiáng)域的火球菌屬樣校正 DNA 聚合酶，使 Profusion™ DNA 聚合酶產(chǎn)生具有高準(zhǔn)確度、靈敏度和抑制劑耐受性的 PCR 序列。 該酶具有 5’→3’DNA 聚合酶活性和 3’→5’核酸外切酶活性，其保真性是 Taq DNA 聚合酶的 100倍。 酶溶液中添加了延伸因子使得該酶具有長(zhǎng)片段擴(kuò)增能力，擴(kuò)增速度達(dá)到 15-30sec/kb ，擴(kuò)增目的片段的長(zhǎng)度可長(zhǎng)達(dá) 20 kb。本產(chǎn)品配備了優(yōu)化緩沖液，添加了 PCR 增強(qiáng)組分，使得該酶適用于復(fù)雜模板的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物為平末端。

　　產(chǎn)品組分

　　組分名稱規(guī)格

　　HRF0085   HRF0086   HRF0087

　　(100 U)  (500 U)   (1000 U)

　　Profusion™ DNA Polymerase (2 U/μL)50 μL250 μL250 μL×2

　　2×Profusion™ PCR buffer (含 Mg2+ )1 mL×31 mL×151 mL×30

　　10mM dNTP100 μL500 μL1000 μL

　　6×DNA loading buffer1 mL1 mL×51 mL×10

　　產(chǎn)品應(yīng)用

　　1.高保真 PCR

　　2.基因克隆

　　3.生成測(cè)序模板

　　4.高 GC 含量 PCR

　　5.長(zhǎng)片段 PCR(長(zhǎng)達(dá) 20 kb)

　　6.突變

　　7.高通量 PCR

　　活性定義

　　用活性化的大馬哈魚(yú)精子 DNA 為模板/引物， 74℃ ，30 min 內(nèi)，攝入 10 nmol 的全核苷酸為酸性不溶物的活性定義為 1 U。

　　運(yùn)輸和保存方法

　　冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，有效期1年。

　　推薦PCR反應(yīng)體系(冰盒上配制)

　　組分體積(μL)終濃度

　　ddH2Oto 50 μL-

　　2×Profusion™ PCR buffer (含 Mg2+ )25 μL1×

　　10mM dNTP1uL0.2mM

　　DNA 模板適量-

　　Primer 正向 (10 μM)2.5 μL0.5 μM

　　Primer 反向 (10 μM)2.5 μL0.5 μM

　　Profusion™ DNA Polymerase (2 U/μL)0.5 μL1 U/50 μL

　　【注】

　　1)試劑使用：使用前請(qǐng)充分融解和混勻。

　　2)聚合酶濃度：推薦使用 1 U/50 μL，可以在 0.5-2 U/50 μL 之間進(jìn)行優(yōu)化，不要超過(guò)2 U/50 μL。

　　3)聚合酶添加：高保真酶有 3’→5’外切酶活性，可能會(huì)降解引物，配制反應(yīng)體系時(shí)，酶應(yīng)該在最后添加。

　　4)Mg2+終濃度： 體系終濃度為 1.5 mM。如有特殊需要，可用 50 mM MgCl2，以 0.2-0.5 mM 為間隔向上摸索。

　　5)高 GC 模板： 高GC含量的片段擴(kuò)增時(shí)，體系中加入終濃度為 3%的 DMSO 有利于擴(kuò)增，可明顯的提高擴(kuò)增的效率。

　　不同模板的推薦使用量(50 μL 反應(yīng)體系)：

　　模板種類(lèi)擴(kuò)增片段1kb-10kb

　　基因組 DNA50 ng-250 ng

　　質(zhì)?；虿《?DNA1pg-10 ng

　　cDNA1-5 μL (不超過(guò) PCR 反應(yīng)總體積的10%)

　　PCR擴(kuò)增程序：有以下三種程序可選擇，優(yōu)先選擇兩步法程序。

　　兩步法(優(yōu)先推薦)

　　循環(huán)步驟溫度時(shí)間 循環(huán)數(shù)

　　預(yù)變性98℃30s1

　　變性98℃5-10 sec25-35

　　延伸72℃15-30 sec/kb

　　終延伸72℃5-10 min1

　　三步法 (常規(guī)程序)

　　循環(huán)步驟溫度時(shí)間 循環(huán)數(shù)

　　預(yù)變性98℃30 sec1

　　變性98℃5-10 sec25-35

　　退火65℃10-30 sec

　　延伸72℃15-30 sec/kb

　　終延伸72℃10 min1

　　【注】

　　1)預(yù)變性溫度和時(shí)間： 推薦溫度： 98℃ ，時(shí)間： 30S ，復(fù)雜和高 GC 含量模板 3 min。

　　2)退火溫度和時(shí)間： 推薦溫度： 72℃，也可根據(jù)需要， 設(shè)立溫度梯度去摸索引物退火的最適溫度。

　　3)延伸溫度和時(shí)間： 推薦溫度： 72℃ 。時(shí)間： 30 sec/kb ，復(fù)雜模板根據(jù)實(shí)際情況可延長(zhǎng)至 60 sec/kb。

　　4)擴(kuò)增產(chǎn)物： 請(qǐng)將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物放置于-20℃保存，防止該酶降解擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物為平末端。

　　注意事項(xiàng)

　　1、本產(chǎn)品僅作科研用途!

　　注：以上資料僅供參考，如需完整說(shuō)明書(shū)，建議聯(lián)系供應(yīng)商獲取最新版本。

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